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¿PARA QUE? En algunas especies los pares cromosómicos no pueden diferenciarse claramente considerando sólo sus componentes distintivos en sentido longitudinal; se debe recurrir a técnicas citológicas especiales para la tinción de los cromosomas, Se evidencian "bandas" transversales (oscuras y claras) que corresponden a los distintos tipos de cromatina.
TECNICAS MAS USADAS
Bandeo G
Bandeo Q
Bandeo R
Bandeo C
Bandeo NOR
BANDEO G
Se utiliza tratamiento con tripsina previo a la utilizacion de Giemsa ya que la tripsina degrada la proteinas y da lugar a bandas claras y oscuras.
Bandas Oscuras: Regiones de ADN ricas en A-T y pobres en genes constitutivos. Bandas Claras: Regiones de ADN con G-C Y en genes constitutivos
Regiones A-T son resistentes a la tripsina lo cual genera una coloración oscura en el bandeamiento.
Mayor nivel de bandas = Mayor calidad del estudio
BANDEO Q
Se basa en el uso de colorantes fluorescentes como la quinqcrina. Dando a lugar bandas brillantes y oscuras. Técnica similar al bandeo G
Bandas Brillantes: Contienen regiones ricas en A-T. Bandas oscuras: G-C
Regiones con G-C reprimen la fluorescencia y por eso no se tiñen, al contrario que las regiones con A-T
No es muy frecuentemente utilizada
BANDEO R Técnica opuesta al bandeamiento y se utiliza
el calor como desnaturalizante o BrdU Bandas oscuras: G-C
Bandas claras: A-T
El calor desnaturaliza las regiones ricas en A-T por eso se visualizan mas las regiones con G-C
BANDEO C
Marcan las regiones pericentromericas.
Centromericas
y
Permite la tinción de la heterocromatina constitutiva.
Se utiliza hidroxido de sodio e hidroxido de bario para desnaturalizar el ADN.
Se usa principalmente para los cromosmas 1, 9 y 16
BANDEO NOR
Marcan las regiones de los organizadores nucleolares acrocentricos.( regiones cromosómicas que forman y mantienen el nucléolo)
BASES MOLECULARES DEL BANDEO CROMOSOMICO.
CLASIFICACIÓN QFQ GTG RFA MORFOLOGICOS RHG THG BANDEOS CROMOSOMICOS
CBG GBG RBA DINAMICOS
RBG GB-AAu RB-AAu
1. 2. 3.
4.
Se basan en técnicas inherentes a la heterogeneidad de la cromatina. Importante la relación con proteínas(histónicas y no histónicas) e interacciones ADN. Se subclasifican en: Técnicas de tinción diferencial Métodos de tinción selectiva Coloraciones con fluoroeromos específicos aislados o combinados con colorantes no fluorecentes Tinciones con anticuerpos fluorecentes.
Nomenclatura Bandeos Morfologicos
1) tipo de bandeo 2) técnica de detección empleada 3) tipo de tinción.
QFQ: Bandas Q por fluorecencia usando quinacrina. GTG: Bandas G por tratamiento enzimático con tripsina utilizando Giemsa. RFA: Bandas R por fluorecencia usando naranja de acridina. RHG: Bandas R mediante desnaturalización térmica utilizando Giemesa. THG: Bandas T por desnaturalización térmica empleando Giemesa. CBG: Bandas C por hidróxido de bario utilizando Giemesa.
Incorporación de una base analoga, (BrdU), en el ADN durante la fase S del ciclo celular. Se denomina también bandeo de replicación debido a la relación existente entre el tiempo de incorporación del BrdU y el patrón de replicación.
Si se incorpora BrdU durante la fase de replicación temprana se obtiene un patrón de bandeo R destacándose las regiones ricas en G-C.
Si se incorpora la base análoga durante la fase tardía de replicación se obtiene un patrón de bandas G, destacándose las zonas de predominio de secuencias A-T.
Los cromosomas pueden visualizarce utilizando distintos métodos de tinción como Giemesa o el naranja de acridina o utilizando anticuerpos específicos
Nomenclatura Bandeos Dinamicos
GBG: Bandas G por incorporación de BrdU utilizando Giemesa. RBA: Bandas R por incorporación de BrdU empleando naranja de acridina. RBG: Bandas R por incorporación de BrdU utilizando Giemesa. GB-AAu: Bandas G por incorporación de BrdU empleando anticuerpos específicos unidos a partículas deoro coloidal. RB-AAu: Bandas R por incorporación de BrdU usando anticuerpos específicos unidos a partículas deoro coloidal.
Bromo desexiuridina (BrdU)
Análogo mutagénicamente activo de la timina, en que el grupo -CH3 en posición 5' se reemplaza por Br. Tratamiento e investigación del cancer debido a que aumenta la susceptibilidad de las células a la radioterapia porque inhibe la reparación de roturas causadas por la radiación en la doble cadena de ADN Agente mutagenico: altera los patrones de transcripción Aumenta la afinidad de las proteinas cromosomales por las zonas de la cadena que contengan BrdU, Altera la unión de proteínas reguladoras a la cadena de ADN, Inhibe la expresión de algunas funciones de diferenciacion celular Provoca alteraciones en la membrana plasmatica.
1.
PROCEDIMIENTO BANDAS G Envejecer las preparaciones en estufa a 65°C / 14h o 3 dias a temperatura ambiente
Bandeo GTG Tripsina desnaturaliza proteinas de cromosomas Tincion Giemsa o Leishman Bandeo G con colorante Wright Protocolo mas usado. Se introduce la preparacion en solucion salina de 2SSC (Citrato trisodico disuelto en NaCl 0,3M) durante 1 minuto a 65°C. Esto permite que se abra la hebra de ADN Lavar la preparacion con agua destilada y secar al aire. Teñir con colorante Wright al 0.25% y tampon Sorensen en proporcion 1 a 3 duraten 3 minutos
PROCEDIMIENTO BANDA C 1.
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CBG bandas C obtenidas con hidroxido Barico usando Giemsa Introducir la preparacion en una cubeta con HCL 0.02N a temperatura ambiente por 10 minutos, lavar con agua y dejar secar al aire Introducir la preparacion en una cubeta a 60°C con Ba(OH)2 saturado durante 1 minuto. Esto despuriniza y desnaturaliza el ADN. Lavar con agua destilada y metanol para eliminar restos de bario dos veces Dejar secar e incubar en 2xSSC a 65°C / 15 min Lavar la preparacion y dejar secar Teñir con colorante Leishman al 20% o Giemsa durate 5 a 10 minutos
Esta tecnica degrada un 50% del material cromosomico lo que dificulta la aplicación posterior de otras tecnicas. El unico material que queda teñido es la heterocromatina constitutiva porque resiste a la degradacion
Procedimiento bandas NOR Añadir 0.2uL de solucion de nitrato de plata al 50% filtrada a la preparacion 2. Adicionar 6 a 8 gotas de formaldehido al 0.3% (acelera la tincion) 3. Incubar a 37°C durante 24h protegido de la luz 1.
BIBLIOGRAFIA
http://www.oocities.org/researchtriangle/lab/25 13/bandeos.htm Cristina Hernando Davalillo, Caracterizacion de Anomalias cromosomicas en diagnostico prenatal y postnatal mediante tecnicas de citogenetica molecular, Tesis Doctoral 2005. http://docentes.cs.urjc.es/~odeluis/Docencia/G enetmed/Bloque_1_2p.pdf http://geneticahumana.tripod.com/libros/page2 01.html http://www.fmed.uba.ar/depto/histo1a/genetica /adm/sg2.pdf
